精品论文

SDS-PAGE分析干旱胁迫对小麦根部蛋白组分的影响

 

张俊红1,段江燕2

(1. 山西师范大学临汾学院,山西 临汾 041000;2. 山西师范大学生命科学学院,山西 临汾 041000)

    摘  要:为了研究小麦对干旱胁迫的应答反应机制,本实验以晋麦47号为研究对象,用40%的PEG-6000对小麦三叶期幼苗进行处理模拟干旱胁迫,同时设置对照,采用尿素/硫脲法提取小麦根部蛋白质,并用考马斯亮蓝法测定根部蛋白样品浓度,之后采用SDS-PAGE技术检测干旱胁迫前后小麦根蛋白含量的变化。使用软件分析后,结果表明,使用干旱胁迫后,小麦根部总蛋白含量和种类都有所变化。B组根部蛋白电泳结果中蛋白条带比CK组少,且实验组的蛋白浓度明显比对照组的小。

关键词:小麦;根蛋白;尿素/硫脲;干旱胁迫;SDS-PAGE

中图分类号:S512.1       文献标识码:A

 

小麦(Triticum aestivum)在我国是一种需求量非常大的粮食作物。它是一种生长在温带的长日照作物,适种范围比较广泛。由于我国人口数目庞大,并且依然在继续增大,粮食危机问题不可小视,小麦的产量高低对粮食问题的解决以及经济社会的稳定发展有着十分重要的作用。近几年,因为气候干旱,水资源严重缺乏,农田水利设施和灌溉系统的不足等多种原因,使我国生产粮食的主要地区遭受了大面积干旱 。尤其是在春天时降雨量减少,将会致使冬小麦的返青率低,长势也不好。干旱成为影响小麦生长发育的主要因素之一。在我国,北方是主要的小麦培育地区,但小麦的整个生育期的平均降水量不足200mm[1]。在干旱的生长环境下,植物为了生存会不断适应环境,其形态特征和生理反应会随之发生一系列的改变,以保证正常生长[2,3,4]。在小麦适应干旱胁迫的生命活动过程中,蛋白质有着极为重要的作用。在研究小麦的抗逆生理特征过程中,探究小麦根部蛋白含量、种类等抗旱性指标对干旱的响应程度,对雷火网站中选育具有优良抗旱性能的小麦具有实际的意义,对提高缺水少雨地区农田的产量提供了理论依据。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,简称SDS-PAGE,由shapiro[5]等人在1967年发现,是20世纪60年代以来在生物化学领域广泛使用的一种易于操作、简便有效的测定蛋白质相对分子量并检验其纯度的方法。SDS作为一种变性剂,与蛋白质结合会使其发生2个方面的改变:因为SDS是带负电且电荷量大大超过蛋白质分子本身所具有的电荷量,所以会使与它结合的多肽链带上均匀的负电荷,导致原有蛋白之间的差别被掩盖,因而所有的SDS-蛋白复合体在电泳时都以相同的Q/M值向正极移动;使蛋白质单体分子的构像发生了变化,SDS-蛋白复合体在水溶液中的形状通常被认为是近似雪茄烟形的长椭圆棒,不同蛋白质的SDS复合体的短轴长度相同但长轴长度与蛋白质的相对分子质量成正比。因此蛋白质分子在进行电泳时,电泳迁移率主要取决于它的相对分子量,而与所带电荷无关。

通过SDS-PAGE,比较蛋白图谱中的蛋白条带和各条带染色深浅、清晰度等,得出各组小麦根部蛋白的差异。小麦的根是其吸收水分和营养的重要器官,在不同的环境中有明显的变化[6],而蛋白质是生命活动的直接载体,所以,对小麦根部蛋白质的研究有重要意义。聚乙二醇是一种具有渗透调节功能的生物大分子,加入土壤中,会与植物根部争夺水分子。本实验以晋麦47号位实验材料,用40%的PEG6000对小麦三叶期幼苗进行处理,在室内模拟大田环境下的干旱胁迫。使小麦根部处在缺失水分的条件下16h后,采用尿素/硫脲发提取蛋白,应用SDS-PAGE电泳等方法对小麦幼苗根系蛋白质组进行分析与研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

晋麦47号、曲拉通X-100、超纯水、蒸馏水、丙酮、过硫酸铵(AP)、尿素、硫脲、十二烷基硫酸钠(SDS)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、N、N、N、N-四甲基乙二胺(TEMED)、0.1%HgCl2、牛血清蛋白(BSA)、冰乙酸、甘油、1mol/L盐酸、甘氨酸、丙烯酰胺(Acr)、85%磷酸、二硫苏糖醇(DTT)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、95%乙醇、考马斯亮蓝G-250、甲叉双丙烯酰胺(Bis),国产分析纯。

1.2 实验仪器与设备

SDS-PAGE电泳系统(美国伯乐公司)、250D数显光照培养箱(金坛市诺实验仪器厂)、LBC系列电子天平(昆山钰恒电子衡量器有限公司)、漩涡混合器XW-80A(上海青浦沪西仪器厂)、TY-80S脱色摇床(金坛市鑫诺实验仪器厂)、CT15RE超速冷冻离心机(Hitachi Koki Co.Ltd)、BCD-206TX海尔冰箱(青岛海尔股份有限公司)、UMAX Powerlook 2100XL-USB彩色扫描仪(利翔航太股份有限公司)、恒温磁力搅拌器

1.3 实验方法

1.3.1 小麦的培养 挑取优质的小麦种子,用0.1%HgCl2消毒后,放入培养皿中。加入适量水浸没小麦,在25℃恒温培养箱中培养至胚根露出,长度适中时(太长不容易往土里种植,太短又会使种子在土壤中出土太慢),即可移栽在土壤中培养。

幼苗长到三叶期时分2组进行处理,分别为实验组:B组(PEG6000处理培养晋麦47号),对照组:CK组(正常培养晋麦47号)。实验组加入10mL40﹪聚乙二醇6000(PEG6000),对照组仍用等量水培养,16h后取小麦根。

1.3.2 小麦根蛋白的提取——尿素/硫脲法

1.3.3 蛋白浓度的测定(Bradford法)

1.3.4 SDS-PAGE电泳分析根部总蛋白

1.3.5 软件分析 用扫描仪扫描背景已脱干净的凝胶图谱,使用软件分析,讨论结果。

2 实验结果及分析

2.1 标准曲线的绘制

图1 牛血清蛋白标准曲线图

标准曲线的回归方程为:y=1.0129x+0.0002

R2=0.9948

小麦根部蛋白含量=(y-0.0002)/1.0129mg

小麦根部蛋白浓度=稀释倍数*[(y-0.0002)/1.0129]/2mg/ml

2.2 样品浓度的测定

由上面的公式可得出蛋白提取液的浓度。

CK组蛋白样品的OD值为:0.311;浓度为:7.68ug/ul;

B组蛋白样品的OD值为:0.253;浓度为:6.25ug/ul。

2.3 电泳图谱分析

1      2     3     4     5    6     7     8     9

 

图2 SDS-PAGE电泳图

 

 

图3 SDS-PAGE电泳泳道分析图

 

图4 各泳道密度曲线图(红色曲线为B组,蓝色为CK组)即蛋白含量对比图

 

图5 B组和CK组蛋白积分光密度对照图

 

用捷达凝胶软件分析SDS-PAGE图后,图3、4和5的结果表明,B组和CK组蛋白条带的数目和染色程度不同。也就是说经过干旱胁迫后,小麦根部蛋白种类和含量都有所变化。其中实验组在干旱胁迫后蛋白种类比对照组减少。通过与标准蛋白的比对发现,实验组B泳道在分子量为23KD附近和19KD附近的蛋白条带比对照组泳道颜色深,说明在该分子量之间实验组比对照组蛋白含量高,可能的原因是干旱胁迫导致小麦根部有关抗性蛋白质的表达。干旱胁迫可以启动植物自身的修复系统,植物为了抵制外界的损伤而启动某种信号通路,增强了有关抗性蛋白的表达。而分子量在76.8KD-25KD之间、20.1KD附近等多处实验组蛋白条带比对照组颜色明显浅,即说明在这些分子量处蛋白质含量实验组比对照组明显减少,可能是因为强的干旱胁迫使植物关闭了某些基因的表达,抑制了蛋白质的合成。从整体看对照组蛋白含量明显高于实验组。

3 讨论

本实验应用SDS-PAGE技术和捷达凝胶电泳分析系统,研究干旱胁迫处理对小麦根部蛋白表达的作用。通过多次反复摸索与实验,发现不同时间的干旱处理对小麦根部蛋白的影响不同,干旱处理12~16h的小麦根部蛋白含量与对照组小麦的差距最大

在实验过程中遇到很多难题,经过不断研究改善实验方法和具体操作后顺利完成实验。整个实验过程中要注意温度的严格把握,包括研磨、离心、药品存放的温度等,防止蛋白质的降解,在处理样品时尽量缩短时间减少步骤。使用SDS-PAGE电泳分析小麦的根蛋白对蛋白纯度有较高的要求,所以本实验采用尿素/硫脲法,此方法较TCA/丙酮法、直接提取法提取的蛋白量多且杂质含量较少,符合电泳样品的标准。尽管如此,在实验过程中,还是遇到样品含盐太多的问题,基于此,在蛋白提取过程中多加了一次丙酮,进一步纯化蛋白。在进行蛋白质浓度测定时,使用了蛋白裂解液代替了传统方法中的水,使实验形成单一变量,减少了误差。为了提高电泳效果,制好的胶放在缓冲液中保鲜膜封口保存一晚,使胶凝固的充分而均匀。另外,在制胶和点样时不能有气泡,以防电泳时电流不畅。

参考文献

[1] M.R.B.Siddique,A.Hamid,and M.S.Islam. Drought stress effects on photosynthetic rate and leaf gas exchange of wheat [J].Bot Bull Acad Sin.1999(40):141-145.

[2] 陈立松,刘星辉.植物抗旱鉴定指标的种类及其综合评价[J].福建雷火网站大学学报,1997,26(1):48-55.

[3] 蒋明义,荆家海.渗透胁迫对水稻膜脂过氧化及体内保护酶系统的影响[J].植物生理学报,1991,17(1):80-84.

[4] 曲东,王保莉,山仑等.干旱条件下磷对玉米SOD和POD活性的影响[J].西北植物学报,1996,24(3):47-51.

[5] Shapiro AL, Viñuela E, Maizel JV Jr. (September 1967). "Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels.". Biochem Biophys Res Commun. 28 (5): 815–820.

[6] 阮松林,童建新,赵航苹.植物响应逆境胁迫蛋白质组学研究进展.杭州雷火网站技术,2007(7).

基金项目:山西省自然科学基金项目(2009011044-2);山西师范大学科技开发与应用重点课题zk1301

作者简介:张俊红(1984-),女,汉族,山西临汾人,山西师范大学临汾学院,助教,研究方向:生物教学与科研工作。 段江燕(1966-),女,汉族,山西临汾人,山西师范大学生命科学学院,教授,研究方向:生化教学和科研工作。

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