精品论文

马褂木组织培养无菌体系的建立

 

黄家华,陈丽华,杨  娟,徐艳霞

(广西大学林学院,广西 南宁530004)

    摘  要:本文以马褂木优良单株当年生嫩枝作为外植体,以MS为基本培养基,研究马褂木组织培养无菌体系的建立。外植体消毒试验结果表明,外植体污染率和死亡率随消毒时间的变化而呈规律性变化,在一定范围内,升汞消毒时间越长,死亡率越大,污染率越低;初代培养的试验结果表明,3种细胞分裂素单独与生长素配合都可以诱导外植体萌芽,但诱导率有一定的差异,外植体萌芽率以TDZ和NAA配合平均萌芽率最高(82.0%),其次是6-BA(77.3%),最差是KT(72.0%);从细胞分裂素浓度来看,TDZ以最低浓度0.05mg/l诱导效果更好,6-BA则以最高的2.0mg/l好,KT各浓度间差异不明显。6-BA+TDZ+IBA生长调节剂组合时,TDZ0.3、0.5、0.7mg/l3种浓度以0.3mg/l萌芽率最高,6-BA1.0、1.5、2.0mg/l3种浓度以1.0mg/l萌芽率最高,IBA0.2mg/l 、0.5mg/l、1.0mg/l3种浓度以0.5mg/l最优。6-BA+KT+IBA生长调节剂组合时,KT0.5、1.5、2.5mg/l3种浓度以2.5mg/l萌芽率最高,6-BA0.5、1.0、2.0mg/l3种浓度以0.5mg/l萌芽率最高,IBA0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l3种浓度以1.5mg/l 最优。

关键词:马褂木;茎段;组织培养;无菌体系

中图分类号:S792.21      文献标识码:A

 

中国马褂木(Liriodendron chinense)属木兰科鹅掌楸属[1],现存资源稀少,被列入国家二级珍稀濒危保护植物[2],分布于我国长江流域以南海拔600~1500m的中、低山地[3]。马褂木生长快、树干通直,木材品质好,是优良的造林树种[4-5]。但马褂木种子繁殖发芽率极低,而且种子繁殖后代性状分化大,而用组织培养方式对优良单株进行无性繁殖既保持亲本优良性状,又能快速繁殖,对马褂木优良遗传材料的利用具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以广西大学林学院苗圃保存的马褂木优良单株当年生嫩枝作为试验材料。

1.2 外植体采集与消毒方法

于晴天采集健壮、无病虫害嫩枝,将叶片和叶柄剪掉,带回实验室,嫩枝剪成含1~3个芽的短枝条,用洗洁精溶液浸洗1min,再在流水下用软毛刷轻轻顺着枝条生长方向刷洗嫩枝后,流水冲洗2h,切取长为1.0~2.5cm的带芽茎段为外植体。用70%酒精消毒30s后,再用0.1%的氯化汞消毒。

1.3 培养条件

外植体接种后先暗培养1周左右,再转白天人工光照12h,光照强度1500lx~2000lx,温度25±2℃的条件下培养。

1.4 试验设计

1.4.1 消毒试验 消毒试验设置6个处理,每个处理接种32瓶,每瓶接1个外植体。消毒方法:70%酒精消毒30s后,无菌水洗2次,然后按表1的设计用氯化汞消毒。接种17天后统计污染率和死亡率。

表1 外植体不同消毒处理

处理
消毒条件
1
0.1%HgCl2 +两滴吐温5min"无菌水洗3次"0.1%HgCl2 +两滴吐温5min
2
0.1%HgCl2 +两滴吐温6min"无菌水洗3次"0.1%HgCl2+两滴吐温6min
3
0.1%HgCl2+两滴吐温7min"无菌水洗3次"0.1%HgCl2+两滴吐温7min
4
0.1%HgCl2+两滴吐温10min
5
0.1%HgCl2+两滴吐温9min
6
0.1%HgCl2+两滴吐温8min

1.4.2 初代培养基试验 以MS为基本培养基,添加不同植物生长调节剂种类和不同浓度配比进行外植体诱导试验,初代培养基均附加30g/L蔗糖,7.0g/L琼脂,PH为5.8。

2 结果与分析

2.1 不同消毒处理对外植体死亡率及污染率的影响

表2是不同消毒处理的试验结果。从污染率看,2段式方法消毒时间越长,污染率越低,累计消毒10min污染率为75.00%,累计消毒14min的污染率为40.63%,污染率明显降低。1段式消毒8、9、10min污染率差异不明显。从未污染外植体的死亡率看,2段式消毒外植体死亡率较低,死亡率最高的处理3(14min)为46.88%。1次消毒的外植体死亡率较高,且与消毒时间呈正相关关系,死亡率最低的处理6(8min)外植体死亡率为46.88%,死亡率最高的处理4(10min)外植体死亡率高达75%。从死亡率和污染率综合分析,马褂木外植体消毒2段式以0.1%HgCl2 7min加0.1%HgCl2 7min的处理较好,而1次消毒以8min的处理较适宜。在消毒时间相同的情况下,2段式消毒(处理1:5min+5min)和一次消毒(处理4:10min)比较,前者的污染率高于后者,而死亡率低与后者,这说明了持续10min的升汞杀菌消毒效果较好,但是对外植体的毒害较大。

 

表2 不同消毒处理对外植体污染率和死亡率的影响

处理
消毒条件
细菌污染率%
霉菌污染率%
污染率%
未污染外植体死亡率%
1
0.1%HgCl2 5min+0.1% HgCl2 5min
68.75
6.25
75.00
37.5
2
0.1%HgCl2 6min+0.1% HgCl2 6min
59.38
9.38
68.75
37.5
3
0.1%HgCl2 7min+0.1% HgCl2 7min
40.63
0.00
40.63
46.88
4
0.1% HgCl2 10min
35.94
18.75
54.69
75.00
5
0.1% HgCl2 9min
46.88
9.38
56.25
50.00
6
0.1% HgCl2 8min
34.38
20.31
54.69
46.88

 

2.2 初代培养试验

2.2.1 不同细胞分裂素种类和浓度对外植体诱导的影响 表3是不同细胞分裂素种类对马褂木初代培养的影响,从表3可以看出,从培养基组合来看,2.0mg/6-BA与0.3mg/LNAA组合外植体萌芽率最高,为93.75%,1.5mg/6-BA与0.3mg/LNAA组合萌芽率最低,为52%;并不呈递增或递减的变化规律。3种细胞分裂素单独与生长素配合都可以诱导外植体萌芽,但诱导率有一定的差异,外植体萌芽率以TDZ和NAA配合平均萌芽率最高(82.0%),其次是6-BA(77.3%),最差是KT(72.0%);从细胞分裂素浓度来看,TDZ以最低浓度0.05mg/l诱导效果更好,6-BA则以最高的浓度2.0mg/l外植体萌芽率最高,KT各浓度间外植体萌芽率差异不明显。从外植体萌芽生长看,TDZ和NAA组合的培养基上的萌芽相对于6-BA与NAA组合和KT与NAA组合培养基上的萌芽,前者节间较短、萌芽比较粗壮、芽及苞片短大、厚,后两者芽茎相对细长。

表3 不同细胞分裂素种类和浓度对初代诱导培养的影响

培养基
6-BAmg/L
TDZmg/L
KTmg/L
NAAmg/L
萌芽率%
平均
1
0.50
0.30
80.95
2
1.00
0.30
82.61
3
1.50
0.30
52.00
4
2.00
0.30
93.75
77.33
5
0.05
0.30
91.67
6
0.10
0.30
89.66
7
0.15
0.30
67.86
8
0.50
0.30
78.79
81.99
9
3.50
0.30
68.75
10
2.50
0.30
75.00
11
1.50
0.30
70.00
12
0.50
0.30
74.19
71.99

2.2.2 6-BA+TDZ+IBA生长调节剂组合对初代诱导的影响 表4是不同浓度6-BA+TDZ+IBA生长调节剂组合对初代培养的影响。从表4可以看出,不同的生长调节剂组合诱导率差异明显,萌芽率最高是13号培养基,为92.86%,最低是19号培养基,为40%。从单一生长调节剂种类的效果分析,TDZ0.3、0.5、0.7 mg/l3种浓度以0.3mg/l萌芽率最高,6-BA1.0、1.5、2.0mg/l3种浓度以1.0 mg/l萌芽率最高,IBA0.2 mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l3种浓度以0.5mg/l最优,说明在所试验的不同生长调节剂浓度范围内,TDZ和6-BA都是以较低浓度有利于马褂木的初代培养,而IBA则以中等浓度更为有利。

表4 不同6-BA+TDZ+IBA生长调节剂组合对初代诱导培养的影响

培养基
6-BA

mg/L

TDZ mg/L
IBA

mg/L

未污染外植体数
萌芽数
萌芽

率%

13
1.0
0.03
0.2
14
13
92.86
14
1.0
0.05
0.5
7
5
71.43
15
1.0
0.07
1.0
7
3
42.86
16
1.5
0.05
0.2
9
4
44.44
17
1.5
0.07
0.5
10
7
70.00
18
1.5
0.03
1.0
7
3
42.86
19
2.0
0.07
0.2
5
2
40.00
20
2.0
0.03
0.5
3
3
100
21
2.0
0.05
1.0
2
1
50

2.2.3 6-BA+KT+IBA生长调节剂组合对初代诱导的影响 从表5可以看出,26号培养基的外植体萌芽率最高,达到92.86%,25号培养基外植体萌芽率最低,为42.86%。从单一生长调节剂种类分析,KT0.5、1.5、2.5mg/l3种浓度以2.5mg/l萌芽率最高,6-BA0.5、1.0、2.0mg/l3种浓度以0.5mg/l萌芽率最高,IBA0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l3种浓度以1.5mg/l最优,说明在所试验的不同生长调节剂浓度范围内,6-BA以较低浓度有利于马褂木的初代培养,而KT和IBA则以较高浓度更为有利。

表5 激素6-BA+KT+IBA组合培养基对外植体诱导培养的影响

培养基
6-BA

mg\L

KT

mg\L

IBA

mg\L

未污染外植体数
萌芽数
萌芽率

%

Q1
0.5
0.5
0.5
21
17
80.95
Q2
0.5
1.5
1.0
19
15
78.95
Q3
0.5
2.5
1.5
18
16
88.89
25
1.0
0.5
1.0
14
6
42.86
26
1.0
1.5
1.5
14
13
92.86
Q6
1.0
2.5
0.5
11
9
81.82
Q7
2.0
0.5
1.5
10
6
60
Q8
2.0
1.5
0.5
16
11
68.75
Q9
2.0
2.5
1.0
19
15
78.95


3 结论

(1)在一定范围内,升汞消毒时间越长,外植体污染率越低,死亡率越高。从污染率看,2段式方法消毒时间越长,污染率越低,累计消毒10min污染率为75.00%,累计消毒14min的污染率为40.63%。1段式消毒8、9、10分钟污染率差异不明显;2种消毒方法未污染外植体的死亡率均与消毒时间呈正相关关系。在消毒时间相同的情况下,2段式消毒(处理1:5min+5min)和1段式消毒(处理4:10min)比较,前者的污染率高于后者,而死亡率低与后者,这说明了持续10min的升汞杀菌消毒效果较好,但是对外植体的毒害较大。从死亡率和污染率综合分析,马褂木外植体消毒2段式以0.1%HgCl2 7min加0.1%HgCl2 7min的处理较好,而一次消毒以8min的处理较适宜。

(2)3种细胞分裂素单独与生长素配合都可以诱导外植体萌芽,但诱导率有一定的差异,外植体萌芽率以TDZ和NAA配合平均萌芽率最高(82.0%),其次是6-BA(77.3%),最差是KT(72.0%);从细胞分裂素浓度来看,TDZ以最低浓度0.05 mg/l诱导效果更好,6-BA则以最高的2.0 mg/l诱导率最高,KT各浓度间差异不明显。

(3)不同浓度6-BA+TDZ+IBA生长调节剂组合对外植体的诱导率差异明显萌芽率最高是13号培养基,为92.86%,最低是19号培养基,为40%。从单一生长调节剂种类的效果分析,TDZ0.3、0.5、0.7mg/l3种浓度以0.3mg/l萌芽率最高,6-BA1.0、1.5、2.0mg/l3种浓度以1.0mg/l萌芽率最高,IBA0.2mg/l、0.5mg/l、1.0mg/l3种浓度以0.5mg/l最优,说明在所试验的不同生长调节剂浓度范围内,TDZ和6-BA都是以较低浓度有利于马褂木的初代培养,而IBA则以中等浓度更为有利。

(4)不同浓度6-BA+KT+IBA生长调节剂组合对外植体诱导效果差异明显,外植体萌芽率最高达到92.86%,最低为42.86%。从单一生长调节剂种类分析,KT0.5、1.5、2.5mg/l三种浓度以2.5mg/l萌芽率最高,6-BA0.5、1.0、2.0mg/l3种浓度以0.5mg/l萌芽率最高,IBA0.5mg/l、1.0mg/l、1.5mg/l3种浓度以1.5mg/l最优,说明在所试验的不同生长调节剂浓度范围内,6-BA以较低浓度有利于马褂木的初代培养,而KT和 IBA则以较高浓度外植体诱导率更高。

参考文献

[1] 叶桂艳编.中国木兰科树种.北京:中国雷火网站出版社,1986.

[2] 傅立国主编.中国植物红皮书—稀有濒危植物(第一册).北京:科学出版社,1992.

[3] 郝日明,贺善安,汤诗杰等.鹅掌楸在中国的自然分布及其特点.植物资源与环

境.1995,4(1):1-6.

[4] 杨文,杨萍,陈波涛等.黎平县鹅掌楸人工林的生长状况调查.贵州林业科技,2005,

33(3):20~23.

[5] 李建民,周志春,陈炳星等.马褂木人工林的生长和制浆造纸性能.中国造纸,

2002(2):5~7.

作者简介:黄家华(1989-),女,汉族,广西合浦人,广西大学硕士研究生,研究方向:林木遗传育种。

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